Si vous êtes un minimum intéressé par l’ingénierie de génomes, les thérapies géniques, ou tout simplement la biologie moléculaire, vous avez forcément entendu au moins une fois ce nom bizarre : CRISPR. Que se cache-t-il exactement derrière cet acronyme, et pourquoi une telle agitation autour de cette technologie ?

CRISPR, ou « Clustered regularly interspaced short palindromic repeats » en anglais, est une technologie récente que beaucoup imaginent tout droit sortie d’un film de science-fiction, ou échappée d’un laboratoire américain gardé top-secret, à base de virus très dangereux créés malencontreusement par des scientifiques un peu fous, et prête à envahir le monde.

Mais comme toujours, il n’en est rien…

CRISPR est un système naturel de défense immunitaire comme nous en possédons tous, bien qu’il soit issu des bactéries. Plus précisément, le type de CRISPR/Cas9 que presque tout le monde utilise est un système que la bactérie Streptococcus pyogenes utilise pour se défendre contre l’invasion des virus et des phages qui lui sont nocifs [1]. Et si vous vous demandiez pourquoi CRISPR est si efficace, vous oubliez probablement que CRISPR a été façonné pendant des millions d’années d’évolution avant que l’homme ne l’utilise à son avantage.

La première publication scientifique ayant rapporté l’existence de CRISPR date de 1987 [2]. A cette époque, personne n’avait la moindre idée de ce que les séquences répétées d’ADN présentes dans le génome des bactéries pouvaient bien être. Il faudra attendre l’année 2000 pour que le bactériologiste espagnol Francis Mojica donne le nom de « CRISPR » à ce système [3] dont la fonction immunitaire ne sera complètement élucidée qu’en 2007 [1]. Enfin, après de longues années passées à essayer de comprendre les mécanismes de fonctionnement de CRISPR, la française Emmanuelle Charpentier et l’américaine Jennifer Doudna démontrent en 2012 que CRISPR peut être manipulé pour être dirigé sur une séquence génomique cible prédéterminée en laboratoire [4]. Quelques mois plus tard le chinois Feng Zhang et le polonais Rudolf Jaenisch démontrent que CRISPR est utilisable chez la souris [5, 6]. Depuis, CRISPR a été utilisé successivement sur un très grand nombre d’espèces végétales et animales, sans jamais montrer la moindre faiblesse. L’histoire de CRISPR est un exemple typique de l’aboutissement du travail acharné et souvent isolé de chercheurs du monde entier (dont plusieurs français) dévoués à la recherche fondamentale, si souvent négligée financièrement et politiquement partout dans le monde [7, 8].

Mais alors, si CRISPR est un système naturel détourné par l’homme à son avantage, pourquoi un tel engouement ?

La réponse tient essentiellement dans le fait que l’arrivée de CRISPR correspond exactement à ce que nombre de personnes attendaient depuis bien longtemps : un système simple, efficace, et applicable à grande échelle pour manipuler le génome de façon contrôlée et précise. Ces trois caractéristiques ont fait de CRISPR une technologie « disruptive », c’est à dire changeant complètement la manière de procéder (à la modification de génomes dans notre cas).

La simplicité de CRISPR est un avantage qui lui a permis de dépasser les systèmes d’endonucléases précédents. A l’état naturel, le système comprend trois éléments :

• L’enzyme Cas9, parfois surnommée ciseau moléculaire, qui coupe l’ADN.
• L’ARN agissant en trans (tracrRNA), est un fragment d’ARN qui va guider Cas9 vers une séquence génomique déterminée. Ce « guide » contient une séquence complémentaire à la séquence génomique cible, avec laquelle il va s’hybrider.
• L’ARN CRISPR (crRNA) est la base du guide à laquelle le tracrRNA se lie pour former un complexe avec Cas9.

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Système naturel a 3 composants	⇒	Optimisation (2 composants)

CRISPR : un système simple et efficace à deux composants

Une des découvertes majeures de Doudna et Charpentier est le fait que les deux morceaux d’ARN peuvent être fusionnés en un seul élément, surnommé l’ARN simple guide (sgRNA), sans perdre son efficacité. Le système actuel ne comprend donc plus que deux éléments : l’enzyme Cas9 et l’ARN guide. Cette simplicité est un facteur essentiel dans le fait que CRISPR a largement et rapidement dépassé des technologies semblables, mais bien plus compliquées à acquérir, synthétiser et appliquer, telles que les nucléases à doigts de zinc (Zinc Finger Nucleases – ZFN en anglais) ou les nucléases proches des activateurs de transcription (Transcription activator-like effector nucleases – TALEN en anglais).

Un facteur non négligeable à la percée fulgurante de CRISPR vient aussi du fait que cette technologie a été intentionnellement mise à la portée de tout un chacun, notamment par la distribution à prix dérisoire de plasmides CRISPR par la société à but non lucratif Addgene. Ces plasmides CRISPR ont inondé les laboratoires du monde entier en un temps record ; un contraste total avec l’acquisition exclusive de la technologie ZFN par Sigma-Aldrich (pour un montant non divulgué) auprès de la compagnie de biotechnologie Sangamo, ou des brevets détenus par la société française Cellectis sur l’utilisation de TALEN.

L’efficacité de CRISPR est aussi un avantage sans précèdent. Au jour d’aujourd’hui, il n’existe aucun organisme vivant sur lequel CRISPR a été testé, et qui ait échoué. Bien entendu cela inclut la souris et le rat de laboratoire, mais aussi des espèces plus proches de l’homme comme le singe [9], ou plus exotique comme l’Axolotl, une salamandre qui possède la capacité incroyable de régénérer ses membres [10]. Enfin, placé dans les mêmes conditions de test, CRISPR se révèle bien souvent plus efficace que TALEN ou ZFN [11]. CRISPR est capable de modifier quasi instantanément une seule base parmi les près de 3 milliards que contiennent chacune de nos cellules dans notre ADN. La puissance de CRISPR est ainsi comparable à celle d’un système de correction automatique d’orthographe capable d’identifier et corriger une seule lettre erronée dans une encyclopédie de trente volumes.

L’applicabilité de la technologie CRISPR semble en outre n’être sans autre limite que l’imagination de ceux qui l’utilisent. Bien entendu la capacité de manipuler les génomes à volonté est une donnée qui crée autant de craintes et scepticisme pour certains, que d’enthousiasme et passion pour d’autres. L’ascension fulgurante de CRISPR s’est faite dans des domaines aussi variés que la création de modèles animaux des maladies humaines, les thérapies géniques pour vaincre des maladies telles que la mucoviscidose [12] ou le virus du SIDA [13], la production de produits biologiques [14], le développement de plantes résistantes aux parasites [15], la lutte contre la résistance aux antibiotiques [16], ou l’éradication de virus tropicaux mortels tel que le virus Zika ou la Dengue [17].

Mais bien entendu, le pouvoir presque magique attribué à CRISPR a pour but ultime la manipulation du génome humain. Et c’est bien là tout l’enjeu de CRISPR. Comme n’importe quelle baguette magique, tout dépend non pas de la baguette en elle-même, mais plutôt de quelles mains tiennent la baguette, et pour en faire quoi. Il est très facile d’imaginer que la manipulation d’embryons humains à des fins personnelles soit très bientôt au rendez-vous. En effet, alors que deux équipes chinoises ont récemment rapporté avoir manipulé des embryons humains [18, 19] avec CRISPR (ce qui est interdit en France), les pionniers et pontes de la technologie se sont immédiatement réunis pour appeler à un moratoire visant à interdire de telles pratiques, invoquant le manque de recul face à une technologie aussi jeune, et un manque d’études sur les effets mutagènes indésirables potentiels de CRISPR [20]. Mais à y regarder de plus près, et en essayant de ne pas tomber dans l’hystérie provoquée par la vision d’un monde où les parents pourraient créer des bébés sur-mesure et à la carte, le temps est très certainement venu pour les gouvernements et autres organismes législatifs et comités d’éthique de plancher sur l’avenir de CRISPR. Et s’il s’avère que des mesures coercitives ou restrictives venaient à être mises en place, il faudra soigneusement penser à ne pas jeter le bébé avec l’eau du bain. Aux Etats-Unis les couples américains n’utilisent-ils pas déjà la FIV pour choisir le sexe et la couleur des yeux de leurs enfants ? Ceci n’a absolument rien à voir avec CRISPR, et est pourtant pratiqué au pays de l’Oncle Sam. Et si de telles pratiques peuvent nous paraître effrayantes, qu’en est-il de l’espoir suscité par l’utilisation de CRISPR suite à un test prénatal pour éradiquer les mutations génétiques à l’origine de maladies infantiles profondément handicapantes, douloureuses, et souvent mortelles ? D’ailleurs, sans même parler de l’embryon humain, que doit décider le législateur face au développement d’une technique permettant l’acquisition d’un trait génétique chez 100% des individus en une seule génération [21]? Doit-on y voir la fin potentielle de virus mortels en créant des moustiques résistants, ou au contraire doit-on envisager la fin de la diversité génétique (et donc de la biodiversité des écosystèmes) par « genetic drift » ?

Il va falloir bien du courage aux décideurs, car si leurs lois, amendements, décrets et autres recommandations connaitront les limites géographiques de leurs circonscriptions, CRISPR ne connaît, lui, aucune frontière. Ainsi, les premiers essais cliniques utilisant la technologie CRISPR ont déjà commencé en Chine [22], en ne sauraient tarder aux Etats-Unis.

A bien y regarder, et au-delà des craintes ou aspirations exprimées, il semble que CRISPR ne fasse qu’exacerber les qualités et défauts de l’être humain. Mais jusqu’à maintenant, CRISPR ne l’a fait qu’à de rares occasions par sa fonction première : la manipulation de génomes. Au contraire, CRISPR s’est jusqu’ici beaucoup illustré par les batailles juridiques sanglantes de ceux qui veulent en détenir les brevets [23], et qui sont essentiellement les institutions accueillant les pionniers de CRISPR, repoussant (jusqu’à quand ?) leur adoubement par une nomination méritée au prix Nobel de médicine. Et dans la course effrénée à la gloire scientifique et la célébrité, certains ont voulu nous faire croire qu’un nouveau système basé sur le microorganisme « Argonaute » allait même dépasser CRISPR [24]. Il n’en fut rien. Ni Argonautes ni astronautes n’atterrirent sur la lune, et la controverse s’en mêla lorsque qu’aucun laboratoire au monde ne parvint à reproduire les résultats imputés à l’Argonaute… [25, 26]

Dans notre laboratoire, CRISPR est arrivé en trombe et a littéralement changé la vie de tout le monde. Et ce fut un bien ! Trente ans après sa découverte, CRISPR nous a permis de produire des souris modélisant le syndrome FoxG1 (une maladie génétique très rare) en un temps record, et à prix minimum. Cela nous a aussi permis de donner espoir aux généreux donateurs qui se battent tous les jours pour financer ce projet par leurs dons, et aux familles affectées par cette maladie, ainsi qu’à leurs proches.

CRISPR est une vraie révolution qui n’a que l’intérêt qu’on voudra bien lui donner…

Pour en savoir plus…

Delerue F & Ittner LM

Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects

Cloning and Transgenesis. 2015, 4:135 doi:10.4172/2168- 9849.1000135

Notes :

1. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007;315(5819):1709-12. doi: 10.1126/science.1138140. PubMed PMID: 17379808.
2. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol. 1987;169(12):5429-33. PubMed PMID: 3316184; PubMed Central PMCID: PMCPMC213968.
3. Mojica FJ, Rodriguez-Valera F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria. FEBS J. 2016;283(17):3162-9. doi: 10.1111/febs.13766. PubMed PMID: 27234458.
4. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829. PubMed PMID: 22745249.
5. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013;153(4):910-8. doi: 10.1016/j.cell.2013.04.025. PubMed PMID: 23643243; PubMed Central PMCID: PMCPMC3969854.
6. Yang H, Wang H, Shivalila CS, Cheng AW, Shi L, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013;154(6):1370-9. doi: 10.1016/j.cell.2013.08.022. PubMed PMID: 23992847; PubMed Central PMCID: PMCPMC3961003.
7. Lander ES. The Heroes of CRISPR. Cell. 2016;164(1-2):18-28. doi: 10.1016/j.cell.2015.12.041. PubMed PMID: 26771483.
8. Ledford H. The unsung heroes of CRISPR. Nature. 2016;535(7612):342-4. doi: 10.1038/535342a. PubMed PMID: 27443723.
9. Niu Y, Shen B, Cui Y, Chen Y, Wang J, Wang L, et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014;156(4):836-43. doi: 10.1016/j.cell.2014.01.027. PubMed PMID: 24486104.
10. Fei JF, Schuez M, Tazaki A, Taniguchi Y, Roensch K, Tanaka EM. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 2014;3(3):444-59. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.06.018. PubMed PMID: 25241743; PubMed Central PMCID: PMCPMC4266004.
11. Yasue A, Mitsui SN, Watanabe T, Sakuma T, Oyadomari S, Yamamoto T, et al. Highly efficient targeted mutagenesis in one-cell mouse embryos mediated by the TALEN and CRISPR/Cas systems. Sci Rep. 2014;4:5705. doi: 10.1038/srep05705. PubMed PMID: 25027812; PubMed Central PMCID: PMCPMC4099983.
12. Schwank G, Koo BK, Sasselli V, Dekkers JF, Heo I, Demircan T, et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 2013;13(6):653-8. doi: 10.1016/j.stem.2013.11.002. PubMed PMID: 24315439.
13. Hu W, Kaminski R, Yang F, Zhang Y, Cosentino L, Li F, et al. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(31):11461-6. doi: 10.1073/pnas.1405186111. PubMed PMID: 25049410; PubMed Central PMCID: PMCPMC4128125.
14. Peng J, Wang Y, Jiang J, Zhou X, Song L, Wang L, et al. Production of Human Albumin in Pigs Through CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes. Sci Rep. 2015;5:16705. doi: 10.1038/srep16705. PubMed PMID: 26560187; PubMed Central PMCID: PMCPMC4642324.
15. Wang Y, Cheng X, Shan Q, Zhang Y, Liu J, Gao C, et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat Biotechnol. 2014;32(9):947-51. doi: 10.1038/nbt.2969. PubMed PMID: 25038773.
16. Bikard D, Euler CW, Jiang W, Nussenzweig PM, Goldberg GW, Duportet X, et al. Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials. Nat Biotechnol. 2014;32(11):1146-50. doi: 10.1038/nbt.3043. PubMed PMID: 25282355; PubMed Central PMCID: PMCPMC4317352.
17. Savidis G, McDougall WM, Meraner P, Perreira JM, Portmann JM, Trincucci G, et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Rep. 2016;16(1):232-46. doi: 10.1016/j.celrep.2016.06.028. PubMed PMID: 27342126.
18. Kang X, He W, Huang Y, Yu Q, Chen Y, Gao X, et al. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 2016;33(5):581-8. doi: 10.1007/s10815-016-0710-8. PubMed PMID: 27052831; PubMed Central PMCID: PMCPMC4870449.
19. Liang P, Xu Y, Zhang X, Ding C, Huang R, Zhang Z, et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015;6(5):363-72. doi: 10.1007/s13238-015-0153-5. PubMed PMID: 25894090; PubMed Central PMCID: PMCPMC4417674.
20. Lanphier E, Urnov F, Haecker SE, Werner M, Smolenski J. Don’t edit the human germ line. Nature. 2015;519(7544):410-1. doi: 10.1038/519410a. PubMed PMID: 25810189.
21. Gantz VM, Bier E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 2015;348(6233):442-4. doi: 10.1126/science.aaa5945. PubMed PMID: 25908821; PubMed Central PMCID: PMCPMC4687737.
22. First-in-human CRISPR trial. Nat Biotechnol. 2016;34(8):796. doi: 10.1038/nbt0816-796a. PubMed PMID: 27504762.
23. Ledford H. Titanic clash over CRISPR patents turns ugly. Nature. 2016;537(7621):460-1. doi: 10.1038/537460a. PubMed PMID: 27652544.
24. Gao F, Shen XZ, Jiang F, Wu Y, Han C. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. Nat Biotechnol. 2016;34(7):768-73. doi: 10.1038/nbt.3547. PubMed PMID: 27136078.
25. Cyranoski D. Updated: NgAgo gene-editing controversy escalates in peer-reviewed papers. Nature. 2016;540(7631):20-1. doi: 10.1038/nature.2016.21023. PubMed PMID: 27905463.
26. Cyranoski D. Replications, ridicule and a recluse: the controversy over NgAgo gene-editing intensifies. Nature. 2016;536(7615):136-7. doi: 10.1038/536136a. PubMed PMID: 27510204.

Fabien Delerue
Chercheur à l’Université de Nouvelle-Galles du Sud (UNSW) à Sydney, en Australie. Dr Delerue a plus de 20 ans d’expérience dans le domaine de la modélisation animale des pathologies humaines. Il a débuté sa carrière au laboratoire de Neurosciences Cognitives (Bordeaux, France) avant de passer 5 ans dans le laboratoire pharmaceutique Hoffmann-La Roche, à Bâle en Suisse. C’est là qu’il est devenu expert en expérimentation préclinique in-vivo, étant responsable de la mise en place de nouveaux modèles comportementaux de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, mais aussi des formes de dépression et schizophrénie. En 2007, Dr Delerue quitte le département « Système Nerveux Central » de Roche pour établir une unité de transgénèse au sein du laboratoire sur les maladies d’Alzheimer et de Parkinson (à l’Institut sur le Cerveau et la Cognition – Université de Sydney). Les recherches entreprises par le Dr Delerue se focalisent sur la production et la caractérisation de nouveaux modèles animaux transgéniques, les maladies neuro-dégénératives, les maladies génétiques rares, l’ingénierie de génomes, et les thérapies géniques. Il est membre de la Société Internationale des Technologies de Transgénèse (ISTT), directeur d’une Unité de Transgénèse Animale (TAU), et enseigne à l’Université dans le cadre d’une Unité de recherche sur les maladies mentales (DRU).